hongkongdoll 视频 Western blotting 实验旨趣及常见问题汇总
本文由孙永宁课题组硕士盘考生姜雅宁供稿hongkongdoll 视频
旨趣：Western blotting，即免疫陈迹技巧或卵白质陈迹技巧。是辨认卵白质的分子杂交技巧。旨趣是将卵白盘考样品在恒定的电流下由于分子量不同而产生不同的电泳速率而分离，经过SDS-PAGE 分离后并转念到固相载体(举例硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDE膜)上，固相载体以非共价键形式吸附卵白质，且能保捏电泳分离的卵白质的相对位置不变。固相载体上的卵白质或多肽看成抗原，与对应的未记号的一抗起免疫响应，再与酶或同位素记号的二抗响应。经过底物显色、化学发光或辐射自显影，用以检测生物组织或细胞某种特定卵白身分的存在和含量。行径：Western blotting 实验历程主要有以下几个行径:1. 卵白样品制备2．SDS-PAGE分离待检测的卵白质；3．转膜:将SDS-PAGE分离的卵白质转念到膜上；4．顽固:即愚弄非响应活性物资顽固固相载体膜上未吸附纠合卵白质的区域；5．抗体纠合:即愚弄相应卵白质的抗体(一抗)与待测卵白质进行免疫纠合，再与酶或同位素记号的第二抗体起响应；6．底物显色或辐射自显影检测电泳分离的特异性诡计卵白的存在与否和含量。图片hongkongdoll 视频
WB实验中可能出现的问题及处置主义
1.Western blot 效果中的布景为什么发黑?
可能的原因及漠视：1)膜顽固不够——延迟顽固的时辰；摄取愈加适应的顽固液。Abcam 推选5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清顽固30 分钟。这些不错包含在抗体缓冲液中。2) 一抗稀释度不适应——挣扎体进行滴度测试，摄取最适应的抗体稀释度。3)一抗孵育的温度偏高——漠视4℃纠合过夜。4)膜在实验历程中干过——实验历程中要预防保捏膜的湿润。5) 检测时曝光时辰过长——减少曝光时辰。6)二抗与顽固剂非特异性纠合或响应——设置二抗对照(不加一抗)。7)一抗或二抗与顽固剂有交叉响应——在孵育和洗涤液中加入暖热去污剂如吐温-20。脱脂奶粉含有酪卵白，该卵白自身便是一种磷酸化卵白，会纠合磷酸化特异性抗体而易产生高布景。使用BSA 代替奶粉看成顽固剂。8) 未纠合卵白质洗涤不充分——加多洗涤次数。9)膜的摄取导致的高布景——NC 膜比PVDF 膜布景低。
2.Western blot 效果中杂带较多可能的原因及漠视
1)诡计卵白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），自身不错呈现多条带。——查阅文件或进行生物信息学分析，得回卵白序列的修饰位点信息，通当年修饰笃定卵白履行大小。2)诡计卵白有其它剪切本——查阅文件或生物信息学分析可能性。3) 样本处理历程入网划卵白首生降解——加入卵白酶扼制剂；样本处理时在冰上操作。4)上样量过高，一般10—20ug——合适减少上样量。5)一抗特异性不高——重新摄取或制备高特异性的抗体。表面上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价钱偏高，是以一般来说多抗饱胀了6)一抗不纯——纯化抗体。7) 一抗大概二抗浓度偏高——镌汰抗体浓度。8)检测到未经报说念过的新卵白或并吞卵白眷属中具有同样表位而结构不同的卵白——查阅其它文件报说念，或BLAST 搜寻。 9)条带为非特异性条带——应用顽固多肽来差别特异性和非特异性条带，只须特异性条带能被顽固从而隐没。10)靶卵白变成多聚体——SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 5—10分钟，后再12000g离心，使卵白质解聚。
3.效果中无信号或泄漏信号弱可能的原因及漠视
1)检测样本不抒发诡计卵白——摄取抗体阐明书上推选的组织或细胞作阳性对照，用于笃定检测样本是否为阴性。2)检测样本诡计卵白抒发量低——普及上样量，不低于20-30ug，裂解液中预防加入卵白酶扼制剂。3)转念不竭对或过转念——不错用丽春红染膜并纠合染胶（考马斯亮蓝）后笃定条带是否转至膜上或转念偏激，pvdf膜较NC膜不易转念偏激；合适疗养转膜时辰和转膜功率。4)一抗孵育时辰不及或一抗不及或一抗失效——漠视 4℃纠合过夜，使用高浓度抗体，使用崭新抗体，重叠使用灵验浓度会镌汰。5)二抗与一抗不匹配——摄取针对一抗起头的种属的抗体。6) 洗膜过度——洗膜时辰不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，漠视使用0.1%的弱去垢剂 Tween-20。7)顽固剂和一抗或二抗有交叉响应——使用使用暖热的去污剂如吐温-20，或更换顽固剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。8)二抗受叠氮钠扼制——幸免叠氮钠和 HRP 记号抗体一齐使用。
4.出现其它表象可能的原因及漠视：
1)膜上多处出现斑点或黑斑——抗体与顽固试剂发生非特异性的纠合，过滤顽固剂。2)反白（条带显白色）——诡计卵白含量太高大概一抗浓度偏高，稀释抗体的浓度。3)卵白分子量偏低或偏高——胶浓度不适应，大分子量要用低浓度胶；小分子卵白要用高浓度胶。4)诡计条带染色过低/过高——分离不透澈，改动凝胶比例：分子量大的卵白用低浓度胶，分子量小的卵白用高浓度胶。5)疏通的卵白杂交出现大小不均匀条带——制备凝胶时凝胶凝固太快，甚而泳说念中丙烯酰胺的比例不均匀，参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量TEMED，扬弃时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干6）.出现“含笑”条带可能的原因及漠视：a 迁徙速渡过快——镌汰电泳电压。b 电泳温渡过高（改动了pH值和迁徙速率）——镌汰迁徙速率或低温电泳(冷库或冰上)。7）.出现凝胶染色不均匀可能的原因及漠视：a 细菌浑浊——4°C保存抗体并使用崭新的缓冲液浸泡凝胶。b 抗体量不及——确保在回荡孵育时抗体充分浸没膜。
一路向西电影国语版5.TBS与PBS的区别：
PBS的缓冲能力强于 TBS（因为夹杂缓冲液在一定的离子强度下时时具有更宽的缓冲范围），TBS在 PH7.0 以下缓冲能力较弱（不外PBS 易浑浊）。但咱们时时要把柄咱们实验诡计选用合适的缓冲液，如在卵白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选 PBS。Western blot 中使用 TBS 和PBS 均可，仅仅要把柄需要摄取合适的浓度。
6.Western是否不错同期加两种大概多种一抗：
时时情况下咱们只加一种一抗。作念Western 在并吞张膜上检测诡计卵白和内对照，亦然先上诡计卵白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上对照的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片。
7.不同固相载体的区别：
硝酸纤维素薄膜纠合卵白的能力为100ug/cm2，概括性能较好，以往使用的东说念主较多:尼龙膜纠合卵白质的能力较强(480ug/cm2)，有很高的灵巧度，但纠合布景较高；PVDF-膜具有较好的纠合卵白质的能力(200ug/cm2)，且能较幽闲地纠合卵白质，该膜的机械性能和化学特点强，不易卷曲或扯破，在90%甲醇的销亡要求下也不会影响膜的结构，纠合在膜上的卵白质不错径直进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。
8.不同浓度的胶何如摄取：
主要依据卵白分子量摄取
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